畢業(yè)論文引言
1 引言
核苷酸及其衍生物在食品、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、化妝品、及生化試劑等領(lǐng)域具有十分廣泛的用途。尤其在我國核苷酸的需求量很大，但主要依靠進(jìn)口，在這個(gè)方面缺口很大[1]。目前核苷酸的生產(chǎn)工藝不完善，利用酶解法生產(chǎn)核苷酸以及酶解工藝條件的研究，在國內(nèi)報(bào)道的很少，國內(nèi)吳莉莉等人曾利用雙酶法降解核酸，生產(chǎn)呈味核苷酸i+g[2]。楊斌等人也對(duì)利用酶解法生產(chǎn)呈味核苷酸的生產(chǎn)進(jìn)行過論述，但是都未曾對(duì)酶解核酸的工藝條件進(jìn)行過優(yōu)化摸索工作。
目前，對(duì)于核苷酸三種主要生產(chǎn)方法相比較而言，酶解法成本低，同時(shí)可以生產(chǎn)四種產(chǎn)品，明顯優(yōu)于其他兩種生產(chǎn)方法。對(duì)于酶解法利用的原料rna，可以從啤酒廢酵母中提取，解決了啤酒廠廢酵母的出路，做到了資源的再生和利用。再對(duì)提取rna的廢酵母考慮綜合利用，可以產(chǎn)生更大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。雖然酶解法生產(chǎn)四種核苷酸有很大的優(yōu)越性，但是，該方法中存在著以下幾個(gè)主要問題:1、原料質(zhì)量差。目前國內(nèi)rna的純度在80%左右，溶解后存在大量的雜蛋白，降低了酶解率。并且由于雜蛋白的存在增加了分離的難度。2、生產(chǎn)的菌株水平低：利用桔青霉作為生產(chǎn)核酸酶p1的菌株，其生產(chǎn)的酶活僅為國外菌株的60%，對(duì)rna的酶解率僅為70-85%，國外酶解率可以達(dá)到85%-95%。3、離交分離收率低：一方面由于酶解不徹底，存在許多雜質(zhì)如寡聚核苷酸等，增加了分離難度；另一方面由于分離材料的選擇性差，對(duì)5’-核苷酸的吸附容量小，不能高效的分離四種核苷酸。4、結(jié)晶技術(shù)不過關(guān)。
所以通過rna水解實(shí)驗(yàn)的研究，對(duì)rna水解條件進(jìn)一步優(yōu)化，得出水解rna的最佳工藝，盡可能多的得到單核苷酸，應(yīng)用在各個(gè)領(lǐng)域。
1.1 核糖核酸酶
1.1.1 概述
從20世紀(jì)60年代以來，核糖核酸酶作為一種模型蛋白被普遍用于分子生物學(xué)研究。核糖核酸酶（rnase）的全名為聚核苷-α-寡核苷酸轉(zhuǎn)移酶，是一類廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)的水解核酸鏈中磷酸二酯鍵的酶。這些酶對(duì)核酸的作用是水解核苷酸殘基之間的磷酸二酯鍵，生成寡聚核苷酸或單核苷酸。rnase的主要生理功能是控制細(xì)胞內(nèi)rna的種類與數(shù)量分布，除參與核糖核酸轉(zhuǎn)錄后的剪切、修飾和降解等過程外，還與某些植物的自交不親和性、器官發(fā)生、宿主的防御機(jī)制、控制腫瘤血管生成、殺滅腫瘤細(xì)胞及抑制病毒復(fù)制等有關(guān)[3]。
1.1.2 核糖核酸酶的分類
根據(jù)酶作用核酸分子部位的不同，可分為3’-磷酸二酯酶和5’-磷酸二酯酶。根據(jù)反應(yīng)的最適ph不同分為酸性核糖核酸酶和堿性核糖核酸酶。酸性核糖核酸酶主要存在于細(xì)胞的溶酶體中，水解所吞噬的異物中的rna；堿性核糖核酸酶存在于胞液中，水解胞液中的rna。根據(jù)降解rna底物的不同一般分為3類：rnaseⅰ既能催化rna 水解，又可催化dna水解，產(chǎn)生5’-單核低聚核糖核苷酸或5’-單核低聚脫氧核糖核苷酸；rnaseⅱ僅使rna釋放2’、3’環(huán)狀嘌呤核糖核苷酸和3’-嘌呤核糖核苷酸；rnaseⅲ只水解rna釋放2’、3’環(huán)狀嘌呤或嘧啶核糖核苷酸和3’-嘌呤或嘧啶核糖核苷酸。根據(jù)酶作用的專一性[2]可分為核酸外切酶①蛇毒磷酸二酯酶：從毒蛇的毒液中提取的，它從核酸的單鏈的3’-oh端開始水解，生成5’-單核苷酸，該酶的最適ph為9，ca2+和mg2+為激活劑，還原劑和螯合劑抑制酶活力；②脾磷酸二酯酶：從牛脾中提取的，水解產(chǎn)物為3’-單核苷酸。核酸內(nèi)切酶：核酸酶s1從米曲霉菌中提取出來的單鏈專一性內(nèi)切酶，產(chǎn)生5’-單核苷酸，最適ph為4.5-5.0，需要zn2+、co2+也可刺激酶活力，但mg2+、ca2+、cu2+無效。該酶對(duì)熱較穩(wěn)定，底物存在時(shí)于65℃保溫不失活。內(nèi)切兼外切酶：核酸酶p1從桔青霉制得的，故又稱桔青5’-磷酸二酯酶，純化的p1酶對(duì)單鏈專一；最適溫度70℃，最適ph5；zn2+為激活劑。8mol/l的尿素和5mol/l的鹽酸胍可抑制酶的活性。核酸酶p1酶還具有3’-磷酸單酯酶的活性，可水解3’-單核苷酸、核苷二磷酸、和3’-二核苷酸的3’磷酸鍵，核酸酶p1酶常常用于制備5’-單核苷酸。